葉綠素a分光光度法操作步驟

葉綠素a分光光度法操作步驟：

將一定量水樣用玻璃纖維濾膜過濾，以90%丙酮為提取液研磨提取水中浮游植物的葉綠素，離心后測定其750nm、664nm、647nm、630nm 波長下的吸光度值，計算葉綠素a 的含量。

測定葉綠素的具體操作步驟如下：

（1） 過濾：

（2） 研磨：

將樣品濾膜放置于研磨裝置中，加入 3~4mL丙酮溶液，研磨至糊狀。補加3~4mL丙酮溶液，繼續研磨，并重復1~2次，保證充分研磨5min以上。將破碎后的細胞提取液轉移至玻璃刻度離心管中，用丙酮溶液沖洗研缽及研磨杵，一并轉移入離心管中，定容至10Ml。

（3） 浸泡提取：

將離心管中的研磨提取液充分震蕩混勻后，用鋁箔包好，放置于4攝氏度下避光浸泡提取2小時以上。

（4） 離心：

將離心管放入離心機，以3000~4000r/min的速度離心10min，然后用針式濾器過濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液待測。

（5） 空白試樣的配置：

用實驗用水按照與試樣的制備相同的步驟進行實驗室空白試樣的制備。

（6） 測定：

將試樣轉移至比色皿中，以丙酮溶液為參比溶液，于波長750nm、664nm、647nm、630nm處測吸光度。

國內外方法中的各種實驗條件總結如下：

（1）提取試劑：

除熱乙醇方法，國內外標準方法均采用90%丙酮作為提取試劑。EPA446.0 指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻類細胞中的葉綠素a，而且不產生其它衍生物。丙酮是國際上提取葉綠素的試劑。

（2）濾膜：

除《水和廢水監測分析方法（第四版）》采用乙酸纖維濾膜外，均采用玻璃纖維濾膜。

（3）樣品保存方法：

樣品的保存條件各種方法略有不同，但水樣采集后均保證4℃冷藏保存，樣品濾膜可冷凍保存。而且葉綠素a 測定樣品濾膜冷凍后再研磨，可提高提取效率。如采樣后不立刻測定，-18℃下冰凍，再于室溫條件下融解，利用細胞內冰粒的形成和細胞液濃度的增高引起溶漲，使胞壁結構破碎引起葉綠素溶出。

（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡：

目前國內也有很多文獻報道了對上述葉綠素a提取方法的改進研究，如延長提取時間。水利部行業標準《葉綠素a的測定分光光度法》（SL88-2012）葉綠素測定的主要操作是低溫反復冷凍提取-避光冷藏浸泡-離心，在EPA的446.0的基礎上改進了提取方法。考慮到不同地區儀器設備的能力差異，-40℃的超低溫冰箱不是所有的環境監測部門均具備的儀器設備，所以將樣品濾膜的冷凍作為輔助的提取條件。

（5）計算公式及波長：

關于計算方法，主要有三色法和單色法，三色法主要考慮了葉綠素b 和葉綠素c 對測定的干擾，測定的是表觀葉綠素a 的含量（包括葉綠素a 與脫鎂葉綠素a 之和），單色法考慮脫鎂葉綠素a 的干擾.從方法的簡便性來說，三色法操作簡單，產生誤差幾率小，耗時比單色法短。